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ODS反相填料的装填

时间:2014-12-09 15:35
来源:网络
作者:AgroIPM
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内容介绍
ODS反相填料的装填
ODS填料是在硅胶基质的表面键合十八烷基,由于其键合的配基和独特的硅胶表面,在物质分离中具有非常好的应用效果,广泛应用于天然产物提取、药物纯化、杂质分离鉴定中。以下将介绍20-150um的ODS填料的装填方法。
一、装填原理
当颗粒粒度大于10µm应采用等密度匀浆装填法。
匀浆技术是用合适的液体润湿颗粒,以消除填充颗粒的聚集结块问题。选择的液体可以减少由重力沉降作用而引起的颗粒粒径分级的现象。当浆液的密度与颗粒密度近似相等时,由重力作用产生的颗粒沉降相应的相应减少。
用湿法填充制备高效柱必须满足下列几项要求:
1.悬浮液中的填料颗粒必须不聚集结块。
2.填料颗粒在装进柱子前应该始终保持悬浮装态不得沉降分级。
3.为得到均匀紧密的柱床填充颗粒的浓度应合适流速尽可能大。
浆液不应与填料反应不使填料降解且填装完毕后应容易除去。填料颗粒必须有足够的强度和硬度。以承受填装过程中的机械应力。
1 一些匀浆填充法用溶剂的性质

溶剂 密度ρ
g/mL
粘度η
cp 20℃
溶剂 密度ρ
g/mL
粘度η
cp 20℃
二碘甲烷 3.3 2.9 1.0 1.0
1,12,2-四溴乙烷 3.0 - 吡啶 1.0 0.9
二溴甲烷 2.5 1.0 四氢呋喃 0.9 0.5
碘甲烷 2.3 0.5 正丁醇 0.8 3.0
四氯乙烯 1.6 0.9 正丙醇 0.8 1.2
四氯化碳 1.6 1.0 乙醇 0.8 0.6
氯仿 1.5 0.6 甲醇 0.8 1.0
三氯乙烯 1.5 0.6 环己烷 0.8 1.0
溴乙烷 1.5 0.4 正庚烷 0.7 0.4
二氯甲烷 1.3 0.4 异辛烷 0.7 0.5
乙二醇 1.11 1.7      
二、装柱前准备
所需要的设备有:泵(HPLC或蠕动泵)、压力表、水平仪、玻璃/聚丙烯酸/PEEK或不锈钢层析柱、储槽(可选)等。
装填前准备工作:
1.柱子清洗干净检查没有明显的破损。
2.检测密封是否严格。
3.柱子要竖立与地面垂直。
4.在装柱前要用装柱的溶剂先冲刷色谱柱、柱筛板、管路
三、装填(在常温下操作)
3.1匀浆
2 每升柱床体积填料量

填料类型 每升柱床填料量
ODS 0.4-0.6 kg/lVc
 
3 建议使用的匀浆溶剂

填料类型 选用溶剂
YMC-ODS 四氯化碳:四氢呋喃=2:1(v/v)
GHGELODS 氯仿:环己醇=1:1(v/v)
SilicycleODS 二氧六环:四氯化碳=1:2(v/v)
 
4 不同的装填方法选用的匀浆体积

装填技术 匀浆体积:柱床体积
轴向压缩 3:1
真空装填 2:1
根据所需装填柱子的体积称取适量的填料到容器里,容器的体积至少是匀浆体积的2倍,再根据具体的装填方式和装填的填料的类型按照表2、3、4制成合理的匀浆。为了充分浸润,建议用超声处理5-15分钟。
3.2恒流速/半恒压装填法
1.将柱底筛板用装填溶剂润湿,并将溶液放空一部分以便赶走所有的气泡。关闭柱底端出口,并在柱底部留出1~2cm高的装填溶剂。
2.再次将浆液搅拌均匀,以确保填料的均一。
3.小心将匀浆液倒入层析柱中,并注意避免倒入时产生气泡。
4.将匀浆液倒入后,用装有装填溶剂的喷壶清洗层析柱的内壁。
5.打开层析柱出口,开启泵或加压装置。最初,应让装填溶剂缓慢流过层析柱或压力逐渐增大。
6.采用恒流速装填法:利用输液泵缓慢输送装填溶剂增加至最终流速,这可以避免液压对于所形成的柱床的冲击,也可以避免柱床形成的不均匀。流速可以阶段性地增大,增加量取决于层析柱的柱尺寸和流速。一般情况下装填流速为使用流速的2-3倍。表5中列举了部分例子。
5 恒流速装填法中流速的增加量举例

柱尺寸 填料粒径 目标流速 操作流速
(I.D.´L) (mL/min) (mL/min)
2.0cm´50cm 20-25um 60-120 20-40
4.0cm´50cm 30-40um 100-200 50-70
4.0cm´50cm 50-75um 180-350 90-120
4.0cm´100cm 75-100um 240-400 120-180
同等内径装填同样粒径的填料,柱长增加时为了降低压力降可以选择适当降低流速。
同样粒径填料装填到柱长相同,内径不同的色谱柱中,柱径大的色谱柱选择更大的流速,以减少洗脱时间。
6 装填溶剂

填料类型 选用溶剂
YMC-ODS 甲醇:水=80:20(v/v)
GHGELODS 甲醇:异丙醇=1:1(v/v)
SilicycleODS  
7.半恒压装填法:利用加压装置缓慢增加至目标压力,这可以避免液压对于所形成的柱床的冲击,也可以避免柱床形成的不均匀。可以通过手动操作增加流速来获得形成柱床所需要的稳定压力。对于ODS填料装填一般的压力5-12Mpa,如15um装填采用6.5Mpa的装填压力。
8.当柱床最终形成后,关闭泵或加压装置,并关闭层析柱出口,色谱柱装填完成。
四、色谱柱平衡与柱效评价
对于ODS填料:柱子的装填一旦完成后,首先用5~10倍柱体积的有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇溶剂,线性流速在5-10cm/min平衡柱床。测试装柱的效果,可以选用低分子量、弱极性的样品(如:尿嘧啶、苯甲酸甲酯、甲苯、萘)(进样量:0.25~1%柱体积)。确定柱子的塔板数及不对称性因子。按上述填装步骤装填的层析柱,在线性流速为5-10 cm/min(取决于填料粒径大小,填料粒径小为降低压力可以降低流速)时,最小的柱塔板数如表五所示、不对称性因子必须在0.8~1.4之间。
7 填料装填最小塔板数

填料粒径
(um)
理论塔板数
(N/m)
20 20000
30 10000
50 5000
70 2500
100 1000
注意:
同等粒径的不同填料,由于填料的具体性质,理论塔板数也会略有不同。
装填后由于装填柱的内径和长度不同,影响了装填后的孔隙率,也会响理论塔板数。
理论塔板数与流速和物质是相关的,不同的物质和流速会得到不同的理论塔板数。
 
 
 
五、装柱的常见问题及原因

As<0.8 As>1.4 理论塔板高度过低
装柱过度 装柱时柱床未被压实、压紧 样品与填料上所键合的官能团或胶体间发生作用而被保留
装柱压力过高 柱头或柱底的筛板发生阻塞
柱床坍塌 柱头处有空隙
  层析柱死体积内有空气
  进样技术不高
峰对称因子As计算:
洗脱峰的峰形应尽可能对称,即对称因子尽可能接近1
As按下列公式计算:As=b/a
其中,a为峰高10%处的前半个峰宽,b为峰高10%处后半个峰宽。
六、填料的再生及保存
ODS填料在使用过程中会有一些污染。为增加填料使用寿命,应选择合适的溶剂进行清洗。
1.一般情况下的常规清洗可以使用100%甲醇,100%丙酮。
2.长时间柱内正常有机物污染,可用75%丙酮:25%异丙醇,或100%异丙醇。
3.顽固有机污染物污染时可以使用100%乙酸乙酯,100%正己烷。
4.使用正己烷或乙酸乙酯前要用异丙醇冲洗柱子保持溶剂相溶。
5.一般情况下要冲洗10个以上的柱体积,冲洗过程中要注意柱子的压力,压力过高时降低流速进行清洗。
6.清洗检测大分子物质的ODS柱可以采用下述溶剂进行清洗后再进行常规清洗

溶剂 组成
乙酸 1%乙酸/水
三氟乙酸 1%三氟乙酸/水
0.1%三氟乙酸/丙醇 40:60(v/v)(降低流速)
脲或者鸟嘌呤 5-8M(调节pH6-8)
氯化钠、硫酸钠、磷酸钠 0.5-1.0M(磷酸钠pH7.0)
DMSO或DMF-水 1:1
 
1、装柱用100%甲醇浸泡混悬数小时,使其膨胀就可以上柱。旧ODS填料的处理:先用100%甲醇浸泡数小时后,依次用甲醇、二氯甲烷、正己烷、二氯甲烷、甲醇洗涤,最后用100%甲醇浸泡即可。
2、平衡的话,可以用洗脱能力稍弱(相对你要分离的化合物而言)的甲醇/水洗脱相平衡约一个柱体积即可。
3、上样样品可用平衡用的洗脱相溶解,上样即可。
4、清洗及日常维护可以用100%甲醇冲洗柱子,或者如果填料比较脏的话可用1当量的盐酸与异丙醇的1:1混合液来处理填料,处理完后用纯甲醇平衡柱子(里面的盐酸,异丙醇应该冲洗干净)。
另:上样的样品最好是色素等杂质已经除得差不多了,这样可以保护填料,延长其使用寿命。

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