制备型液相色谱（PLC）-探索梯度

 

图1：快速探索梯度。随着梯度斜率减小，分离度增大
运行探索梯度之后，在进行下一步之前应审查并评估所得结果，弄清以下问题：

• 快速探索梯度的分离度是否足以分离目标化合物？
• 快速探索梯度的速度或效率是否满足要求？
• 采用所需上样量时，目标化合物与其它峰能否保持分离？

如果探索梯度结果未达到要求，可通过方法聚焦进行优化，也可通过更改pH值、溶剂或其它色谱变量对分离方法进行整体调整。
优化方法
通过改变强溶剂和弱溶剂组成可优化目标化合物分离度理想的探索梯度。溶剂组成可以保持恒定（等度），也可以根据给定的单位时间或色谱柱体积进行变化（梯度）。
等度洗脱
在等度分离中，弱溶剂和强溶剂比率在单位时间内保持不变。等度溶剂可由分析人员离线制备，或使用能以恒定的预定流速配比不同溶剂的HPLC泵通过在线混合制得。这种洗脱模式便捷、一致且稳定，因为在系统间转移方法时，延迟体积对保留时间的影响可以忽略不计。
等度洗脱有一定缺陷，并不是所有分离都适用。它的一些固有问题包括：早期洗脱峰分离度低、因峰拖尾导致峰对称性不佳、由于谱带增宽导致灵敏度降低，以及由于强保留化合物积累导致色谱柱污染问题等。
梯度洗脱
反相色谱或离子交换色谱中的梯度分离通常在线混合流动相，以便在整个分析过程中使有机溶剂比例稳定升高。梯度开始时，溶剂强度较低，分析物会被分配到固定相中或保留在色谱柱柱头。随着溶剂强度增加，分析物被转移到流动相，沿色谱柱移动，最终被洗脱。
梯度洗脱可在合理的时间范围内分离疏水性不同的多种分析物。另外，梯度洗脱还可提高峰分离度，由于峰高增加，灵敏度也有所提升。强保留组分会在运行结束时从色谱柱中洗脱出来，因此还可尽可能减少色谱柱污染。
当然，梯度洗脱也存在一些弊端。该方法要求实现一致、无脉冲的在线梯度混合，因此通常需要昂贵的泵设备。此外，采用某些溶剂的组合混合流动相时，可能会产生沉淀。由于梯度结束后需要重新平衡，运行时间会很长，而且因为仪器驻留时间(Vd)不同，若不适当使用补偿溶剂，会带来方法转换问题。
线性梯度
在整个运行过程中，线性梯度的强溶剂比例以恒定速率增加。该方法常在快速筛选实验中被用于快速确定洗脱目标峰的溶剂比例，同时保持较短的运行时间，从而缩短洗脱时间并降低溶剂成本。


图2：线性梯度的溶剂曲线

分段梯度
分段梯度是多个线性梯度的组合，每个区段具有不同的斜率或陡度。平缓的区段用于分离目标化合物，而陡峭的区段是对色谱图分离度要求不高的区域（例如分离后的清洗过程）。

图3：分段梯度的溶剂曲线

梯度聚焦
梯度聚焦通常比分段梯度的运行时间更短且变化更大。
一般情况下，刚进样时流动相的溶剂强度非常低，接下来溶剂强度会迅速升至洗脱目标化合物所需的溶剂比例以下2%-5％（例如，洗脱浓度22% - 2％ = 20％开始平缓梯度）。然后运行平缓梯度，梯度斜率约为快速探索分离所确定的斜率的1/5，最后终止于目标化合物的洗脱浓度以上2%-5％（例如，22% + 2% = 24%终止平缓梯度）。最后，溶剂百分比快速增加，用以清洗残留在色谱柱中的所有样品组分。

 图4：梯度聚焦的溶剂曲线

开发梯度聚焦
采用快速探索梯度分析样品之后，可利用以下公式为目标化合物开发梯度聚焦。首先必须确定探索梯度运行所用仪器的系统延迟体积。关于延迟体积测定的说明可参阅本初学者指南的“延迟体积测定”部分，或访问https://www.waters.com/webassets/other/lp/prep_calc/AnalyticaltoPrep/NewPrepcalculator.htm ，使用“分析级至制备级梯度转换器”应用工具获取。此外，还需确定探索梯度运行所用色谱柱的柱体积。使用圆柱体体积V = πr²h和除去填料所占体积之后的可用柱体积比例可计算出该值，例如V = πr²h (66%)。“分析级至制备级梯度转换器”应用程序工具也可用于执行此计算。

公式1：色谱柱体积
色谱柱体积 = π r² x 长度 x 66%（可用于流动相的比例）/1000（将mm³转换为mL）
示例：
CV = 3.14 x (4.6 mm/2)² x 50 mm x 0.66/1000
CV = 548 mm³ = 0.548 mL

公式2：梯度形成和检测器之间的补偿体积
补偿体积 = 系统体积* + 色谱柱体积
*系统体积或延迟体积
示例：
补偿体积 = 1.04 mL + 0.548 mL
补偿体积 = 1.588 mL

公式3：到达检测器所需的时间
到达检测器所需的时间 = 补偿体积(mL)/流速(mL/min)
示例：
到达检测器所需的时间 = 1.588 mL/1.5 mL/min
到达检测器所需的时间 = 1.06 min

公式4：达到洗脱浓度的时间
达到洗脱浓度的时间 = 目标峰保留时间 – 到达检测器所需的时间 – 梯度保持时间
示例：
达到洗脱浓度的时间 = 6.0 min – 1.06 min – 0.0 min
达到洗脱浓度的时间 = 4.94 min

公式5：洗脱浓度百分比
%洗脱浓度 = 达到洗脱浓度的时间/探索梯度区段时间 x 探索梯度变化 + 初始探索梯度%
示例：
% 洗脱浓度 = 4.94 min/6.0 min x 90% + 5%
% 洗脱浓度 = 79.1%

公式6：色谱柱体积(CV)数
色谱柱体积数 = 1色谱柱体积/mL x 流速mL/min x 探索梯度区段时间
示例：
# CV = 1 CV/0.548 mL x 1.5 mL/min x 6 min
# CV = 16.4

公式7：探索梯度斜率
探索梯度斜率 = %探索梯度变化/色谱柱体积数
示例：
探索梯度斜率 = (95% – 5%)/16.4 CV
探索梯度斜率 = 5.49%/CV

公式8：梯度聚焦斜率
梯度聚焦斜率 = 1/5 x 探索梯度斜率
示例：
梯度聚焦斜率 = 1/5 x 5.49%/CV
梯度聚焦斜率 = 1.1%/CV
梯度聚焦区段为：估算洗脱比例以下5%至该比例以上3%~5%。例如，洗脱比例为79%。

公式9：梯度聚焦区段的时长
梯度聚焦区段的时长 = %梯度范围 x (1/探索梯度斜率) x 色谱柱体积 x (1/流速)
示例：
梯度聚焦区段的时长 = (79%+5%) - (79%-5%) x (1/1.1%) x (0.548 mL) x (1/1.5 mL/min)
梯度聚焦区段的时长 = 3.32 min

最后一步是使用上述公式计算出的值创建梯度聚焦。