读懂天然产物系列——做一个天然产物界的思想者

发布日期：2016-06-14 16:23 来源：网络作者：网络浏览次数：

以下文章转载自小木虫lanseyimi。
　　相信不少从事天然产物方向的同学都会有过这样的想法：“天然产物不就是过几根柱子，做个核磁，对比一下文献，或者查个微谱，然后大多数的化合物就这样“比”出来了。至于有没有活性，是不是新化合物或者是新骨架（还未必解出来）那只有听天由命了。” 在相当长的一段时间里，我也始终把自己看做这样一个“操作工”，甚至是很不合格的操作工，因为不少微量化合物总是悄悄从我的指尖溜走。为此，我苦恼了很久，并终下决心要修炼好自己的“操作工”本领，于是从早到晚，无论寒暑，实验室里总能看到我忙忙碌碌过柱子的身影。一年下来，我的“操作工作”进步不少，而自己得到的只是十几个令大家嗤之以鼻的结构简单且活性一般的已知化合物。于是我知道，作为一名科研工作者，“操作工”只是一个最基础的角色，我们真正要做的是像罗丹笔下的“思想者”那样勤于思考善于思考的人，那样才是科学界最有魅力的王者。
   在写这段文字前，我首先想到的便是介绍一下近些年来天然产物研究中广泛使用的一些新的思路与方法，比如使用LC-MS（UPLC-MS）进行化合物排重，NMR 跟踪，以及 LC-MS-NMR 结合筛选化合物，但前面几位撰写评论的前辈，已经将这些方法介绍的淋漓尽致。于是我不得不寻找新的切入点来开始我今天的文字。
   我将以下面三篇文献来介绍这些“思想者”们的工作……

   文献一介绍了一种“Whole-Cell Mediated”的方法来获得11位羟基化的柠檬苦素类化合物。近年来通过基因改造，重组DNA等生物手段来诱导微生物产生特定化合物已经成为天然产物研究的热点。本人是纯化学出身，因此对于这种高科技感觉一窍不通。幸运的是这篇文献介绍的方法可以让我这种对于生物学一窍不通的“门外汉”也可以先小试牛刀。
   通常来说，我们要获得11位柠檬苦素类化合物有两种方法：
   1、通过半合成的方法，将具有柠檬苦素骨架的化合物（文中化合物1, 2, 3）羟基化得到。这种方法的难点在于：首先，柠檬苦素类化合物构象很稳定不易于反应；其次，由于取代位置甲基的存在，存在空间位阻；再次，11, 12 位的亚甲基在一般条件下也不易得失电子发生反应；另外，基本骨架结构中所存在的酯基等基团在加入合成试剂或在加热、酸碱条件下很容易分解。因此要通过半合成方法得到目标化合物费时费力费财。
   2、可从微生物中提取特定的羟基化酶，催化底物生成羟基化产物，或者将调控该酶的特定基因序列插入到某微生物基因序列中，从而得到目标产物。
   所谓“Whole-Cell Mediated”，字面意思为全细胞介导，通读文章后个人理解为，既然我们就是需要羟基化酶来催化底物生成目标产物，那我们何不直接将目标产物放入能够产生羟基化酶的微生物培养基中进行生物催化，这样酶可以在自己适应的环境中发挥作用，避免了提取酶的过程中造成酶的失活以及复杂的操作过程。
   这种方法突然使我想到了在研究微生物次级代谢产物前体的过程中，我们通常将推测的前体化合物用同位素标记后加入到微生物的培养基当中，发酵后通过核磁手段来观察该同位素是否存在于目标化合物中，从而验证我们推测的前体化合物的正确性。当然还有一个简单粗略的方法，就是在培养基中加入一定量的前体化合物，将发酵后的目标化合物产量与没有加入前体的微生物培养基产生的目标化合物产量进行比较，若产量明显提高，则可以粗略验证我们推测的前体化合物的正确性。
   我不太明白的一点，文章当中也没有详细说明，如何筛选出这种能够介导柠檬苦素类化合物发生11位羟基化的菌株。是从成千上万的菌株中漫无目的的寻找，还是通过查找文献，看哪一种属的菌株中存在11位羟基化酶，或者曾经从哪种菌株中提取过这种羟基化酶，然后在选定的种属中进行筛选。我想对于我们从事天然产物的人来说是不是采用后一种方法更为方便一些啊，原谅我又偷懒了……另外一个问题是，文章中用 0.2 mL 的丙酮溶解化合物加入培养基当中，这 0.2 mL 丙酮会不会对微生物产生影响？文章当中并没有讨论不同溶剂的对该菌株的影响……

   接下来这篇文献也是我最近读到的一篇JOC上的文章，该文章首先吸引我的就是其化合物含磷，并含有罕见的磷酸三酯，且通过VCD计算确定了化合物的绝对构型。原谅我见少识窄，很少见到过含磷的天然产物，而且该天然产物中的磷还存在构型问题。磷的手性是如何定义的？对于碳来讲，当一个碳原子连接四个不同的基团，这个碳是手性碳。磷存在三价和五价的情况，三价当然好理解，连有三个不同基团的三价磷就具有手性。对于五价磷该如何理解呢？原谅我本科有机化学没学好，查阅了一下有机课本，对于S, P, N, As 等，当它们和四个不同的基团相连时，具有光学活性。因此并不是我想当然的以为五价磷就要连接五个不同的基团才具有手性。这是我读这篇文献遇到的第一个问题。我遇到的第二个问题就是当确定磷酸三酯的位置时，文中说通过 C 和 P 的偶合常数来判断。再次感觉到了自己的孤陋寡闻，很少关注含磷化合物，因此基本上对于此类化合物一窍不通，让大家见笑了。
   这篇文章的另一个亮点我认为是 VCD 计算。由于文中分到的化合物含有较长的侧链，因此在搜索最优构象的时候是非常困难的。由于侧链对于化合物构型的影响有限，因此将侧链切除后的化合物进行 VCD 计算，这样结构刚性较大，搜索到的最优构象也较为准确。我在之前分到的化合物计算 ECD 的时候也遇到过这种情况，当时还在考虑切掉测链计算审稿人会不会质疑，现在终于发现文献依据啦！据我查阅文献，国内通过 VCD 计算确定天然产物绝对构型应用的还比较少，可能与仪器及测试价格有很大关系，但 VCD 与 ECD 相比较其应用优势是显而易见的，也许过几年 VCD 会比 ECD 更加普遍吧。

最后我要介绍的一篇文献，给我的启示是在于化合物绝对构型的确定，还有就是提醒我们要善于去做化合物的衍生物。40元大环内酯类化合物，对于我来说想要确定它的平面结构都是一件非常困难的事情，何况绝对构型呢！之前我也读过有关这类化合物的文献，但是都只是确定了平面结构，甚至连相对构型都没有解决。解决这类化合物的绝对构型，我能想到的方法中要么是全合成，要么是得到晶体了。由于这种化合物柔性太大，通过计算的方法是不可能解决其构型问题的。最好的办法就是拿到它的单晶了，可是这是谈何容易！这么大的结构又是油状化合物！文中通过将化合物与对硝基苯甲酰氯反应，得到对硝基苯甲酸酯类化合物，然后通过不断的条件摸索，终于首次得到了这类化合物的单晶，从而确定了化合物的绝对构型。这给我们的思路就是在化合物得不到单晶的时候为什么不能做一些衍生反应培养晶体呢？我们知道含氯、溴、硝基等基团的化合物容易形成单晶，那我们为什么不能人为引入这些基团然后培养单晶呢？不仅在单晶培养方面，在活性方面我们也可以得到启发。我们往往分到一些活性不是很好的化合物，那我们为什么不能通过衍生化反应来寻找活性化合物呢？也许仅仅是加上一个卤素原子，或是形成一个酯键，活性就会有天翻地覆的变化。我们知道很多药物当中含有氟，那我们能不能尝试在我们的化合物当中引入氟原子，然后测试一下活性呢？
其实天然产物研究是需要脑力和体力劳动相结合的，在开始实验之前我们要查阅大量文献，确定自己的实验思路，实验一定要有目的性，而不是盲目的分几个化合物。其次在得到化合物需要解决问题时，更要考验我们这些“思想者”的能力。如果只是千篇一律的模仿前人而不敢尝试新的东西，那只能永远停留在“操作工”的水平。